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共沉淀法是什么|原理圖（共沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)及方法有哪些）

標(biāo)簽：添加時(shí)間：2022-11-23 瀏覽次數(shù):3949

　　共沉淀法是什么|原理圖（共沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)及方法有哪些）

　　生物個(gè)體的許多生命活動(dòng)過程都與蛋白質(zhì)相互作用有密切的聯(lián)系，因此隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，研究蛋白質(zhì)相互作用成為了揭示各種生命活動(dòng)機(jī)制的必要步驟。迄今已經(jīng)發(fā)展出了多種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)和方法，例如免疫共沉淀，酵母雙雜交技術(shù)，雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)和串聯(lián)親和純化聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法等。

　　Co-IP是一種基于抗原與抗體的專一性結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。這種方法常用于鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否存在相互作用，也可以用于確定某種已知蛋白質(zhì)和其他未知蛋白質(zhì)之間的相互作用。

　　Co-IP的基本原理：首先在非變性條件下使用溫和的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，此時(shí)存在于完整細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用被保留了下來。隨后向細(xì)胞裂解液中加入偶聯(lián)某種抗體的瓊脂糖珠并進(jìn)行孵育。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A被其抗體特異識(shí)別并結(jié)合后，A可以與其抗體免疫沉淀，那么在細(xì)胞內(nèi)與A存在相互作用的蛋白質(zhì)或者蛋白復(fù)合物B也能沉淀下來。利用洗脫液洗脫沉淀下來的蛋白，通過Western blotting對(duì)這些蛋白進(jìn)行鑒定和分析。

　　實(shí)驗(yàn)方法

　　收集已同時(shí)表達(dá)蛋白X和蛋白Y的細(xì)胞。

　　吸凈細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS小心漂洗一次，然后加入500μl預(yù)冷的Lysis/IP buffer，于冰上放置15 min，每隔幾分鐘晃動(dòng)一次。

　　將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi)，于4℃，13,000 rpm離心5 min。

　　將離心后的上清留取少量樣品后（所留樣品加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，混合后，于100℃煮沸5 min，離心后放置-20℃保存?zhèn)溆茫瑢?duì)蛋白含量進(jìn)行定量，補(bǔ)充Lysis/IP buffer至1 ml左右，然后分別加入50μl 50％的Progein G beads，于4℃環(huán)境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h以除去Protein G beads非特異結(jié)合的蛋白。

　　于4℃，13,000 rpm離心5 min，將上清液再次轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi)，加入1μl的正常小鼠IgG或者是FLAG單克隆抗體，于4℃環(huán)境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h，使抗體與蛋白進(jìn)行特異結(jié)合。

　　加入50μl 50％的Protein G beads，于4℃環(huán)境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h，使Protein G beads與抗體結(jié)合。

　　于4℃，13,000 rpm離心5 min，棄上清，然后用Lysis/IP buffer洗滌三次，每次都在4℃環(huán)境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)15 min。

　　最后一次洗滌完畢，棄上清，管中只剩下beads，加入25μl的2×蛋白上樣緩沖液，混合后，于100℃煮沸5 min，離心后即可上樣SDS-PAGE膠或者放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

　　注意事項(xiàng)

　　細(xì)胞裂解要采用溫和的裂解條件，避免破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白間相互作用，裂解、洗滌時(shí)需使用非變性裂解液，如NP-40和Triton X-100。

　　由于不同細(xì)胞裂解條件不一樣，建議通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定最佳條件。

　　抗體的選擇十分重要，選經(jīng)過IP驗(yàn)證的抗體，可以減少假陽性概率。

　　注意抗體/緩沖液的比例，抗體稀釋過度不利于后續(xù)抗原抗體結(jié)合；而抗體過多就不能完全沉降在固相基質(zhì)上，殘存于上清。

　　操作時(shí)，為了避免損傷beads，使用大口徑或截短槍頭進(jìn)行加樣。

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